Гелевые карты для определения группы крови инструкция

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

Введение

Гелевая технология в микропробирках (ГТМ) была предложена Y. Lapierre в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле «сефадекс», помещенном в микропробирки. Обычно система представляет собой пластиковые карты, содержащие микропробирки, заполненные гелем (патент DiaMed AG, Швейцария). Иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидкофазных системах.

Одним из наиболее важных условий получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабофиксированных антител в процессе отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста.

Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата.

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Принцип гелевого теста

Забуференный декстрановый гель Sephadex^ТМ G 100 superline может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками — в отличие от стандартных серологических методик — с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме. Если условия центрифугирования не выполняются (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое) могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий (форсировании) центрифугирования. Использование автоматической ID-центрифуги (ДиаМед) устраняет эти проблемы. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

1. нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым, и ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
2. специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл и т.д.)
3. антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста (реакции Кумбса) при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером частиц геля и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета — отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще — положительный результат.

Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

• сильноположительный (++++) — образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
• положительный (+++) — агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
• слабоположительный (++) — агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
• очень слабоположительный (+) — агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
• отрицательный (-) — эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

Оборудование и реактивы

• ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;
• ID-центрифуга для центрифугирования карт;
• термостат на +37°С;
• штатив для пробирок и карт;
• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;
• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);
• перчатки резиновые хирургические;
• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);
• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы — LISS, РНИС);
• 0,9% раствор хлорида натрия;
• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Характеристика идентификационных карт

Идентификационные карты (ID-карты) Диа-Мед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (сtl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-СDЕ-сtl или С-с-Е-е-К-ctl. Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты «Coombs / Enzyme Test»: в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические — к иммуноглобулинам различных классов) — реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.

Общие правила использования идентификационных карт

1. Идентификационные карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-25°С. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках.
2. Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8°С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.
3. Во избежание получения ложных результатов исследований, запрещается использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа или при повреждении оболочки.
4. Заготовка крови осуществляется с применением современных флеботомических методик, а также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.

Типирование антигенов эритроцитов

ID-карты ДиаМед предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты ДиаМед можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DСЕ, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер.

• Алгоритм проведения исследований [показать] .
• Дальнейшие действия [показать] .

Используемые ID-карты

При определении групп крови и резус-принадлежности применяют поликлональные (табл. 18.10 [показать] ) и моноклональные (табл. 18.11 [показать] ) реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.

По современной классификации лица с ослабленным вариантом антигена D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z антигена D. Лица категории VI (резус-отрицательные реципиенты, но резус-положительные доноры!) могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Для подтверждения группы крови используют различные ID-карты: D(IV^–) — для реципиентов, D(IV⁺) — для доноров.

Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция) (табл. 18.12 [показать] ).

Для углубленного обследования используют другие карты (табл. 18.13-18.14 [показать] ).

Выявление антиэритроцитарных антител

Принцип метода

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активность и оценивается от ++++ до +.

• Алгоритм проведения исследований [показать] .
• Интерпретация результатов [показать] .

Скрининг и идентификация антител

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент (табл. 18.15-18.16 [показать] ). В первом случае для исследования используются обработанные ферментом эритроциты, во втором — суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

Методы исследования антител к антигенам эритроцитов

• Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса) [показать] .
• Ферментный метод [показать] .
• Метод холодовой агглютинации [показать] .

Определение совместимости крови донора и реципиента

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора — наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа. Проведение такой пробы позволяет:

1. подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;
2. выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов(табл.18.17 [показать] ) не заменяет обязательное имуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.

Ввиду того, что сенсибилизация может появиться даже после трансфузий индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо использовать каждый раз свежую сыворотку пациента, полученную после последней трансфузии гемокомпонентов.

Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора!

• Ход определения [показать]
• Результаты пробы на совместимость (4, 5 микропробирки) [показать]
• Ограничения [показать]
• Условия хранения и эксплуатации [показать]

Заключение

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.

Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для учебных целей в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод.

Гелевый тест выполняется и оценивается по выше приведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого атиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные результаты.

Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, 2001

Современные условия труда в централизованной клинико- диагностической лаборатории (ЦКДЛ) требуют выполнения большого количества исследований в минимальные сроки.

Задача статьи — доказать преимущество использования гелевых технологий в работе лабораторий и перейти от рутинной ручной работы к автоматизированным технологиям. Новый этап развития лабораторной диагностики характеризуется постоянным ростом информации, обусловленным совершенствованием лабораторной техники. Повышение качества необходимо на всех этапах исследования: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом.

Определение групп крови методом гелевых карт дает возможность сократить время исследования на одного пациента. Использование современных гелевых технологий дает возможность выполнять в рутинной практике набор тестов, ранее доступных только референтным лабораториям, и облегчает работу практикующих врачей.

Ручные методики определения групповой принадлежности имеют недостатки: скорость определения на плоскости значительно снижена, по сравнению с методикой определения на анализаторах крови.

Приказ Министерства здравоохранения РФ от 20.10.2020 г. №1134н «Об утверждении порядка медицинского обследования реципиента, проведение проб на индивидуальную совместимость, включая биологическую пробу, при трансфузии донорской крови и (или) ее компонентов» позволяет регламентировать работу медицинских организаций.    

Правильность определения групповой принадлежности пациентов по системе АВО имеет большое клиническое значение для предотвращения посттрансфузионных осложнений.  К факторам риска относятся в первую очередь ошибки учета образцов и записи результатов, технические ошибки выполнения процедуры (в том числе и технические ошибки лаборатории), однако биологические факторы также имеют значительное влияние на правильность определения АВО. Снижение рисков причинения вреда при переливании несовместимой по системе АВО крови – одно из ведущих направлений в разработке международных и национальных стандартов. Широкое внедрение стандартизации операционных процедур, автоматизации и непрерывной документальной прослеживаемости результатов, позволили сократить количество технических и документальных лабораторных ошибок.

Гелевая технология для иммуногематологических исследований. Задачами лабораторной службы в иммуногематологии являются использование современных методов исследований в лаборатории для определения группы крови по системе АВО. Доказано, что гелевая система является более чувствительной, чем традиционные серологические методы. Гелевый тест позволяет более эффективно использовать рабочее время сотрудников и свести к минимуму значимость результатов реакции от «рук» исполнителя.

Иммуногематологические методы, используемые в клинической лабораторной диагностике:

1. Агглютинация на плоскости с использованием моноклональных антител
2. Агглютинация в пробирках
3. Агглютинация в микропланшетах (объективная регистрация результатов, возможность автоматизации)

Существующие проблемы тестов на плоскости:

-варьирующее качество реагентов, в том числе по сериям;

— отсутствие объективной регистрации результатов и хранения результатов;

— потенциально риск ошибок, связанных с ручным выполнением теста;

-риски инфекционной безопасности персонала и др.

Проблемы традиционных методов иммуногематологических исследований.

1. Объем трудозатрат, невозможность автоматизации
2. Навык чтения результатов специалистами => субъективность в интерпретации слабо-положительных результатов
3. Нестабильность агглютинационной картины
4. Критическая фаза отмывки, ложные слабо-положительные/отрицательные результаты
5. Агглютинационная картина нестабильна, возможно деградация положительного результата
6. Вариабельность результатов, полученных различными исполнителями
7. Вариабельность между лабораториями
8. Определение трудноопределяемых групп крови (табл. 1)

Таблица 1

Категории пациентов, у которых встречаются затруднения

при определении основных групп крови АВО.

Преимущество гелевой технологии.

1. Принцип гель-фильтрации в сочетании с качеством моноклональных антител обеспечивает высокую чувствительность и специфичность метода, все реагенты имеют стандартную дозировку, наличие контроля качества реагентов. Данный метод является референтным при скрининге и идентификации антител, более безопасен для персонала.
2. Простая интерпретация результатов: положительная реакция (сверху геля), отрицательная реакция (внизу геля)
3. Удобен и прост в использовании: сокращение времени исследования в

2 — 5 раз при проведении скрининга антител, проб на совместимость с отсутствием этапа отмывания эритроцитов, с возможностью автоматизированной оценки и фотодокументирования результатов.

1. Быстрая обучаемость персонала.
2. Сводит к минимуму ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.
3. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или служить учебным пособием в сложно-диагностируемых случаях.
4. Возможность использования небольших количеств крови – актуально при использование в педиатрии — неонатологии, когда получение достаточных количеств материала (необходимых для других методик) затруднено.
5. Позволяют снизить риск заражения персонала, даже  с потенциально инфицированными образцами.
6. Пластиковые карты сделаны из биоразлагаемого материала, легко утилизируются и не загрязняют окружающую среду.
7. 10)Тест – система стабильна и сохраняется в течение года при комнатной температуре.
8. Единственный метод выявления посттрансфузионных химер!!!

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

1.Быстрое и точное определение группы крови, резус-принадлежности,

в том числе в сложных случаях

2.Широкое типирование антигенов эритроцитов всех известных систем

3.Скрининг и идентификация аллоантиэритроцитарных антител

4.Индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания

5.Диагностика посттрансфузионных осложнений и гемолитической

болезни новорожденных

6.Определение редких антигенов (до 76 различных профилей исследований)

Оборудование и реактивы

• ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;

• ID-центрифуга для центрифугирования карт;

• термостат на +37°С;

• штатив для пробирок и карт;

• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;

• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);

• перчатки резиновые хирургические;

• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);

• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы — LISS, РНИС);

• 0,9% раствор хлорида натрия;

• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Основные группы гелевых тестов

1. Определение группы крови по системе АВО

– Прямой и перекрестный метод, определение подгрупп (доноры, реципиенты, беременные, новорожденные)

1. Определение антигена-D системы Резус

– Определение резус-принадлежности (доноры, реципиенты, беременные, новорожденные)

– Выявление вариантных антигенов (доноры, беременные,

новорожденные)

     3) Фенотипирование

– Определение антигенов С, с, Е, е, К (доноры эритроцитсодержащих

гемкомпонентов, некоторые группы реципиентов)

   4) Скрининг и идентификация антиэритроцитарных антител

– Непрямой метод Кумбса (доноры, реципиенты, беременные)

   5) Проба на совместимость

– Непрямой метод Кумбса (доноры, реципиенты)

   6) Определение АТ на поверхности эритроцитов:

– Прямая проба Кумбса (новорожденные, реципиенты)

Принцип гелевого теста.

Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

1) нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым и ферментативным методами, на холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);

2) специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Rh, Kell и т.д.);

3) антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста, т.е. реакции Кумбса, при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, в пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Картинка с сайта: scilead.ru

Исследуемые или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем идентификационные карты центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют на дне микропробирки компактный осадок красного цвета — отрицательный результат; агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля (в зависимости от размеров агглютинатов) – положительный результат.

Интерпретация результатов

В современной ЦКДЛ, оснащенной по требованиям  качества и компетентности в лабораторной диагностике, необходимость в использовании современных технологий назрела на начальных этапах становления лаборатории.

Использование гелевых технологий дает возможность выполнить в рамках рутинной практики набор тестов доступных ранее только референтным лабораториям.

ID-гелевые карты – «ЗОЛОТОЙ СТАНДАРТ ИММУНОГЕМАТОЛОГИИ»

УДК 616.15. — 615.38 О.А. Искакова

АО «Республиканский научный центр неотложной медицинской помощи», г. Астана

ПРИМЕНЕНИЕ ГЕЛЕВОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ КРОВИ

Аннотация

Статья содержит сведения о гелевой технологии, используемой для иммуногематологических исследований крови, принципах гелевого теста, характеристику идентификационных карт. Здесь же описывается клиническая значимость и преимущества гелевой технологии, а также представлены результаты некоторых исследований. Предназначено для специалистов, занимающихся иммуногематологическими исследованиями в трансфузиологии, трансплантологии, гематологии, иммунологии.

Ключевые слова: иммуногематология, гелевые технологии, стандартизация гемагглютинации.

Введение. Гелевая технология была предложена Y.Lapierre в 1989г. — основана на агглютинации эритроцитов в агаровом геле «сефадекс», помещенных в микропробирки и внедрена с целью стандартизации реакций гемагглютинации с получением достоверных результатов.

Обычно иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, проводятся в жидкофазных системах. Ложные, слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста, за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки (вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов), могут стать причиной ошибок и неверно интерпретированы, особенно неопытным персоналом.

Гелевая технология использует комбинацию методов агглютинации и гель-фильтрации.

Тесты включают в себя: определение группы крови, Rh-фактора, фенотипа эритроцитов, антиглобулино-вый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах. Также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь.

Характеристика идентификационных карт. Идентификационные карты (ID-карты) представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля со специфическими моноклональными антителами и антиглобулиновым реагентом, предназначены для определения группы крови по системе АВ0 и Rh-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов.

Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (otl).

Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-CDE-rtl или С-с-Е-е-K-oti.

Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты «Coombs / Enzyme Test»: в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические — к иммуноглобулинам различных классов) — реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.

Принцип гелевого теста. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

1) нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым и ферментативным методами, на холодо-вой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);

2) специфический, содержащий антитела (монокло-нальные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВ0, Rh, Kell и т.д.);

3) антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулино-вого теста, т.е. реакции Кумбса, при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Исследуемые или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем идентификационные карты центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют на дне микропробирки компактный осадок красного цвета — отрицательный результат; агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля (в зависимости от размеров агглютинатов) — положительный результат.

В зависимости от силы реакции агглютинации в ге-левой среде принята следующая оценка полученных результатов:

• сильно-положительный (++++) — образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;

• положительный (+++) — агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;

• слабо-положительный (++) — агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;

• очень слабо-положительный (+) — агглютинаты располагаются в нижней трети геля;

• отрицательный (-) — эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

Размер частиц геля, специальный подбор монокло-нальных или поликлональных антител позволяет достичь наилучших результатов чувствительности и специфичности, а его прозрачность делает считывание результатов более надежным и позволяет интерпретировать самые сложные диагностические случаи.

Клиническая значимость. Принцип безопасности трансфузий эритросодержащих гемокомпонентов воз-

можно осуществлять за счёт выявления предшествующей сенсибилизации. Это достигается обязательным для всех реципиентов скринингом нерегулярных анти-эритроцитарных антител имеющее клиническое значение, способные вызывать in vivo разрушение эритроцитов, имеющих на мембране соответствующий антиген. Присутствие которых, вызывает возникновение пост-трансфузионной гемолитической реакции и осложнения, гемолитической болезни новорожденных или укорочение времени выживания перелитых эритроцитов. При отсутствии антител (отрицательный результат скрининга) эритросодержащие среды выбирают только с учётом группы крови по системе АВ0 и Rh(D) принадлежности. Положительный результат скрининга говорит об «опасном» реципиенте, которому трансфузии гемокомпонен-тов осуществляют только по индивидуальному подбору с обязательным исключением антигена, к которому выявлена сенсибилизация. В таких случаях целесообразно выполнять типирование эритроцитов реципиента по антигенам С,с,Е,е системы Rh, антигену К системы Kell и другим для точных рекомендаций по выбору гемоком-понентов для трансфузий. Это относится также к реципиентам, которым планируются многократные трансфузии гемокомпонентов (пациенты гематологических, онкологических стационаров, гемодиализа, реципиенты органов и тканей). Таким реципиентам индивидуальный подбор проводится не только с учётом выявления предшествующей сенсибилизации, но и с обязательным фенотипированием эритроцитов.

Для исследования вышеуказанных антигенов эритроцитов и антител к ним используются различные методы, наиболее чувствительным и специфичным из которых является гелевый тест.

Основные преимущества использования геле-вой технологии:

• Высокая чувствительность и специфичность тестов, что позволяет проводить диагностику слабых вариантов антигенов и антител (включая А2, А3; Du, DVI);

• Единственный метод выявления посттрансфузи-онных и посттрансплантационных «химер»;

• Объективизация, стандартизация и возможность фотодокументации результатов исследований для сохранения их в архиве или использования для учебных пособий;

• Автоматизации выполнения исследований и компьютерной обработки результатов;

• Удобство и простота в исследовании, повышение безопасности персонала: отсутствие этапов отмывания эритроцитов; исследование крови, заготовленной на консервантах и стабилизаторах без искажения результатов; сокращение времени на проведение полного иммуногематологического исследования в 2-5 раз; снижение риска заражения персонала инфекциями, передающимися через кровь;

• Возможность использования небольших количеств крови — актуально при использование в педиатрии — неона-

Определение резус-принадлежности (D, CDE)

тологии, когда получение достаточных количеств материала (необходимых для других методик) затруднено;

Оборудование и реактивы.

• Ю-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;

• Ю-центрифуга для центрифугирования карт;

• термостат на +37°С;

• штатив для пробирок и карт;

• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;

• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);

• перчатки резиновые хирургические;

• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);

• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы — LISS, РНИС);

• 0,9% раствор хлорида натрия;

• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Таблица 1.

Результаты исследования антигенов группы крови

Выявляемые антигены Заключение

А В АВ D CDE

+ + + + + АВ Rh+

+ + + — — АВ Rh-

+ — + + + А Rh+

+ — + — — А Rh-

— + + + + В Rh+

— + + — — В Rh-

— — — + + 0 Rh+

— — — — — 0 Rh-

Примечание: Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем Ю-карты.

Таблица 2.

Группа крови Результаты исследования с сыворотками

анти-А анти-В анти-АВ

0 (1) — — —

А1 (II) ++++ — ++++

А2 (II) ++++ — ++++

А3 (II) ++/+++ — ++/++++

Ах (II)* -/++ — +/++

В (II) — ++++ ++++

В3 (III) — +/+++ +/+++

Вх (III)* — -/++ -/++

А1В (IV) ++++ ++++ ++++

А2В (IV) +++/++++ ++++ ++++

Примечание: * — определение очень слабых вариантов антигенов А и В требует дальнейших исследований.

Таблица 3.

Резус-принадлежность Результаты исследования с сыворотками

D-положительная ++++ ++++

D-отрицательная — —

D-отрицательная, С Е-положительная* —

Слабоположительная (Du) От ± до +++ от +++ до ++++

Примечание: * — Положительная реакция с сывороткой анти^Е при отрицательной реакции с сывороткой анти-D свидетельствует о наличии антигенов С, Е и требует дальнейшего типирования с использованием Ю-карт: С-с-Е-е-К-сИ или С-С«-с-Е-е-К

Ю-карточки

А-В-Лв-й-йСЕ- Контроль — для определения групп крови АВО^Н. Каждая микропробирка (1-5) содержит специфические моноклональнные антитела, 6 — контроль содержит нейтральный гель.

АВ°’ АВ02 IBI АВОЗ 1АВ1 RH 1 IDI IWl СИ

L Bio-Rad 1 1 470401 J

Ю-карточки

А-В-й-Контроль-Нейтр-Нейтр — для определения групп крови АВО^Н перекрестным методом. Микропробирка 1 содержит анти — А, 2 — анти-В, 3 — Анти-О, 4 — контрольная, 5 и 6 -нейтральный гель.

ABOl lAI AB02 IBI RH1 I СИ IDI 1 Neutr. Neutr.

L Bio-Rad 1 470428 j

Ю-карточки

Кумбс + нейтральные — для скрининга антиэритроци-тарных антител (непрямая реакция Кумбса и ферментный тест).

Первые три микропробирки содержат гель с анти-глобулиновой сывороткой для проведения реакции Кумбса в растворе низкой ионной силы (РНИС). Последние три — нейтральный гель для выполнения солевой или ферментативной реакции с папаином

AHG | AHG | AHG Neutr. Neutr. Neutr.

I 1 1 1 1 1 Bio-Rad 470419

Ю-карточки

Кумбс анти — !дО, анти — !дО, C3d (АГС) — прямая реакция Кумбса. Микропробирки содержат гель с антигло-булиновой сывороткой для проведения реакции Кумбса в растворе низкой ионной силы (РНИС).

Выводы. Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, выполнения теста, сводятся к минимуму затрат рабочего времени и ошибок, встречающиеся при традиционных методиках.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Тесты позволяют перепроверять полученные данные, для контроля, так как могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами.

Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого антиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время.

Литература:

1. Жибурт Е.Б. Трансфузиология. Издательский дом «Питер», — 2002. — 345с.

2. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии. — Санкт-Петербург. — 2004.

3. БготНоу 1.М. Гелевая технология в серологии групп крови // Вестник службы крови России. — №1, январь — 1998. — С. 23-24.

4. Волкова О.Я. Применение гелевой технологии «Скангель» для иммуногематологических исследований крови доноров и реципиентов гемокомпонентов. Методические рекомендации. — Санкт-Петербург. — 2008. -65с.

Т^жырым

КАННЫН, ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯЛЬЩ ЗЕРТТЕУЛЕР1 YШIН ГЕЛД1К ТЕХНОЛОГИЯНЫ КОЛДАНУ

О.А. Искакова

АК «Республикалык жедел медициналык кемек корсету гылыми орталыгы», Астана к-

Макала канды иммуногематологиялык зерттеу Yшiн колданылатын гелдiк технология, гелдiк сынактама туралы мэлiметтердi жэне сэйкестендiру карталарыныц сипаттамасын ^сынады. М^нда гелдiк технологияныц клиникалык мацыздылыгы мен артыкшылыктары, сонымен катар бiркатар зерттеулердiн нэтижелерi карастырылган. Аталмыш ж^мыс трансфузиология, трансплантология, гематология, иммуногология салаларында иммуногематологиялык зерттеулермен айналысатын мамандарга арналады.

Негiзгi сездер: иммуногематология, гелдк технологиялар, гемагглютинацияны стандарттау.

Summary

GEL TECHNOLOGIES FOR THE IMMUNE HEMATOLOGICAL BLOOD TESTING

O.A. Iskakova

JSC «Republican Research Center for Emergency Care», Astana

The article elaborates on use of gel technologies at immunohematology blood studies, principles of gel tests, and characteristics of identification cards. Next, the article continues with describing clinical importance and advantages of gel technology, as well as presents a number of research results. This is a recommended reading for specialists practicing immunohematology studies in transfusiology, transplantology, hematology and immunology.

Key words: the immunohematology, gel technologies, gemagglyutination standartizing.

УДК 612.014.482.4-017.1

С.Е. Узбекова, Б.А. Жетписбаев, А.К. Мусайнова, Д.Е. Узбеков, Г.С. Шалгимбаева

Государственный медицинский университет города Семей

ВЛИЯНИЕ ИМУНОФАНА НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ФАГОЦИТАРНОЕ ЗВЕНО ИММУНИТЕТА ОРГАНИЗМА, ОБЛУЧЕННОГО ФРАКЦИОНИРОВАННОЙ ДОЗОЙ В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ

Аннотация

В статье отражены результаты влияния имунофана на показатели фагоцитарного фактора иммунной системы у необлученных животных и в отдаленном периоде после после фракционированного гамма-облучения. В результате экспериментов были получены данные, что у интактных животных под влиянием имунофана фагоцитоз достоверно повышается с 36±2,4 до 42,6±1,5, а фагоцитарное число — в 1,6 раза. При этом имунофан в 3 раза повышает НСТ-тест. Под воздействием имунофана в отдаленном периоде после облучения происходит нормализация фагоцитарных факторов неспецифической резистентности организма.

Ключевые слова: фракционированное гамма-излучение, иммунная система, иммунопротекторы, отдаленные последствия облучения.

Реализация восстановительных процессов в организме облегчается при фракционированном облучении и при уменьшении мощности дозы, однако, во всех случаях восстановление не может быть абсолютным, некоторая доля повреждений может оставаться необратимой и участвовать в формировании отдаленных последствий. Поэтому поиск эффективных препаратов для профилактики отдаленных последствий радиационных поражений продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины.

Цель исследования

Целью нашего исследования явилась оценка влияния имунофана на фагоцитарное звено иммунитета интактного организма, а также в отдаленном периоде после фракционированного гамма-облучения.

Материалы и методы исследования. Животных подвергали в течение 3 недель облучению гамма лучами Со60 на радиотерапевтической установке «ЛУЧ-1», суммарная доза облучения составила 6 Гр. Контрольными для данной группы служили интактные животные (п=10). До и через 90 дней после облучения и проведенного курса имунофаном (в течение 10 дней по общепринятой схеме) у всех животных определяли показатели фагоцитарного фактора иммунной системы.

Полученные цифровые данные обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики по методике Е.В. Монцевичюте-Эрингене с вычислением критериев Стьюдента с оценкой степени достоверности различий между сравниваемыми группами. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программы Microsoft Excel 2000.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами было исследовано влияние имунофана на неспецифическое фагоцитарное звено иммунной системы необлученных животных. Результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что у интактных животных под влиянием имунофана фагоцитоз достоверно повышается с 36±2,4 до 42,6±1,5, а фагоцитарное число — в 1,6 раза. При этом имунофан в 3 раза повышает НСТ-тест.

В дальнейшем нами изучалось влияние имунофана на неспецифическое фагоцитарное звено иммунной системы облученных фракционированной дозой животных в отдаленном периоде (таблица 2).

Из таблицы 2 мы видим, что под воздействием иму-нофана происходит достоверное снижение НСТ-теста до 2,4±0,2 (P<0,05), фагоцитоза до 24,8±3,9, а фагоцитарное число снижается до нормы.